LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 Biyolojik Aktivite

Laboratuvar ortamında

Vahşi tip ve G2019S transdüksiyonu, 2.5 kat daha yüksek TR-FRET sinyali ile sonuçlanır veLRRK2-IN-1sırasıyla 0.08 uM ve 0.03 uM IC50 değerleri ile doza bağımlı bir tarzda [1]. LRRK2-IN-1, DCLK2'nin inhibisyonu için 45 nM'lik bir IC50'ye sahipti ve AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1 ve PLK1 için biyokimyasal analizlerde değerlendirildiğinde 1 uM'den daha büyük bir IC50 sergiledi. LRRK2-IN-1'in 160 nM EC50 ile MAPK7'yi inhibe ettiği doğrulanmıştır. LRRK2-IN-1, HEK293 hücrelerine stabil şekilde transfekte edilen hem vahşi tip LRRK2 hem de LRRK2 [G2019S] 'ye 14-3-3 bağlanma kaybının eşlik ettiği Ser910 ve Ser935 fosforilasyonunun doza bağlı bir inhibisyonunu indükler [2]. LRRK2-IN-1, HepG2 hücrelerinde 49.3 uM'lik IC50 ile orta derecede sitotoksiktir. LRRK2-IN-1, sırasıyla 15.6 ve 3.9 uM'de S9 varlığında ve yokluğunda genotoksisite gösterir [3]. LRRK2-IN-1, çoğalmayı, göçü engeller ve HCT116 ve AsPC-1 hücrelerinin apoptozu ile hücre ölümünü indükler [4].

In Vivo

LRRK2-IN-1 (100 mg / kg, ip), farelerin böbreğinde LRRK2'nin fosforilasyonunu indükler [2]. LRRK2-IN-1'in (100 mg / kg) peritümöral enjeksiyonu, AsPC-1 tümör ksenograftlarının tümör hacminde ve ağırlığında önemli bir azalmayla sonuçlanır [4].

Kinaz Deneyi

Aktif GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) ve GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527 ) enzim, uygun cDNA yapılarının geçici transfeksiyonunu takiben 36 saat HEK293 hücre lizatından glutatyon sefaroz ile saflaştırılır. Çift kopya halinde gerçekleştirilen peptit kinaz deneyleri, 50 mM Tris / HCl, pH 7.5, 0.1 mM'de 0.5 ug LRRK2 kinaz içeren (yaklaşık% 10 saflıkta nihai bir 8 nM konsantrasyon verir) toplam 40 uL hacminde ayarlanır. EGTA, 10 mM MgCl2, 20 uM Niktid, 0.1 uM [p-32P] ATP (500 cpm / pmol) ve belirtilen inhibitör konsantrasyonları DMSO içinde çözüldü. 30 ° C'de 15 dakika inkübasyondan sonra reaksiyonlar, 35 uL reaksiyon karışımının P81 fosfoselüloz kağıda lekelenmesi ve 50 mM fosforik aside daldırılmasıyla sona erdirilir. Numuneler yoğun bir şekilde yıkanır ve [p-32P] ATP'nin Niktide dahil edilmesi Cerenkov sayımı ile nicelendirilir. IC50 değerleri, doğrusal olmayan regresyon analizi kullanılarak GraphPad Prism ile hesaplanır.

Hücre Deneyi

Hücreler (oyuk başına 104 hücre) 96 oyuklu bir doku kültürü plakasına üç kez ekilir. Hücreler, 0, 0.31, 0.63, 1, 2 ve 5, 10 ve 20 uM'de bir araç olarak DMSO ile LRRK2-IN-1 varlığında kültürlenir. İşlemden 48 saat sonra, her bir oyuğa 10 uL TACS MTT Reaktifi ilave edilir ve hücreler, hücrelerde koyu kristal çökelti görünene kadar 37 ° C'de inkübe edilir. Daha sonra oyuklara 100 uL 266 mM NH40H kuyucuklara ilave edilir ve 1 dakika boyunca düşük hızda bir plaka çalkalayıcıya yerleştirilir. Çalkalandıktan sonra plakanın ışıktan koruyarak 10 dakika inkübe edilmesine izin verilir ve her oyuk için OD550 bir mikroplaka okuyucu kullanılarak okunur. Sonuçların ortalaması alınır ve DMSO (araç) kontrolü + / - ortalamanın standart hatası yüzdesi olarak hesaplanır.

Hayvan Yöneticisi

LRRK2-IN-1Captisol içinde çözülür ve vahşi tip erkek C57BL / 6 farelerine 100 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulanır. Kontrol farelerine eşit hacimde Captisol enjekte edilir. 1 ve 2 saatlik zaman noktalarında, fareler, servikal dislokasyon ile söndürülür ve böbrek ve beyin dokusu sıvı azot içinde hızla parçalanır ve çabucak dondurulur.

Referanslar

[1]. Hermanson SB, vd. LRRK2 Ser935 Fosforilasyonu için Yüksek Verimli TR-FRET Hücresel Deneyi Kullanan Yeni LRRK2 İnhibitörlerinin Taranması. 2012; 7 (8): e43580. EPUB 2012 Ağustos 28.

[2]. Deng, Xianming., Vd. Parkinson&# 39 hastalığının kinaz LRRK2'sinin seçici bir inhibitörünün karakterizasyonu. Nature Chemical Biology (2011), 7 (4), 203-205'te açıklanmaktadır.

[3]. Koshibu K, vd. Parkinson' s Farmakolojik Çalışmaları için LRRK2-IN-1 alternatifi. Farmakoloji. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. Weygant N ve diğ. Küçük molekül kinaz inhibitörü LRRK2-IN-1, çiftkortin benzeri kinaz 1 inhibisyonu ile kolorektal ve pankreas kanserine karşı güçlü aktivite gösterir. Mol Kanseri. 6 Mayıs 2014; 13: 103